Das Serienfinale beginnt mit den Gotham Knights hinter Gittern: Rebecca March hat der Gruppe die Verbrechen des geheimen Court of Owls angehängt, sodass sie für den Mord verantwortlich gemacht und verhört werden. Um sich zu befreien und die Stadt zu warnen, müssen die Jugendlichen der Polizei und ganz Gotham beweisen, dass nicht sie den neuen Bürgermeister und dessen Frau getötet haben – während die Talons ihnen bereits auf den Fersen sind.
Rebecca March verfolgt einen verheerenden Plan: Sie will mehrere Gebäude in der Stadt in die Luft sprengen. In einem Wettlauf gegen die Zeit setzen die Knights alles daran, den Anschlag zu vereiteln und die wahre Verantwortliche zu entlarven. Die Folge stellt das Vertrauen der Gruppe auf die Probe – nur wenn sie einander vertrauen, können sie sich und Gotham retten.
Parallel vollzieht sich Harvey Dents endgültige Wandlung. Erstmals tritt er körperlich wie mental vollständig als Two-Face auf. Er sucht Jane Doe, die Mutter von Duela, auf, um sich für den Verrat an ihrer gemeinsamen Tochter zu rächen. Bereit, sie zu töten, überlässt er die Entscheidung dem Wurf seiner Münze.
Im Finale geben die Gotham Knights ihre Identitäten öffentlich preis, um Gotham vor der drohenden Zerstörung durch Rebecca March zu bewahren. Turner wird zu dem Mann gebracht, der einst seine als Assassinen ausgebildeten Eltern und auch Batman trainiert hat – und der ihm nun anbietet, ihn selbst auszubilden.
Da die Serie nach der ersten Staffel eingestellt wurde, bildet „Die Nacht der Eulen“ zugleich den endgültigen Abschluss von Gotham Knights. Der offene Ausblick auf Turners Ausbildung bleibt damit ein Handlungsfaden, der nicht mehr weitergeführt wird.
