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Nach der Ermordung von Bruce Wayne wird öffentlich, dass er Batman war. Duela Dent — die angebliche Tochter des Jokers — sowie die Geschwister Harper und Cullen Row werden festgenommen, nachdem sie im Wayne Tower die Waffe von Joe Chill stehlen wollten, und als Hauptverdächtige des Mordes beschuldigt.
Bruces Adoptivsohn Turner Hayes, der nichts von Batmans Geheimidentität ahnte, entdeckt mit seiner besten Freundin Stephanie Brown die Bathöhle. Als Stephanie feststellt, dass Geld von Turners Konto an die Verdächtigen floss, wird auch Turner verhaftet.
Weil Bruces Anwälte ihn nicht vertreten, verbündet sich Turner mit Duela, Harper und Cullen, um aus dem Gewahrsam zu fliehen und die wahren Mörder zu finden. Carrie Kelley rettet die Gruppe in ihrer Rolle als Robin vor Detective Ford und korrupten Polizisten.
Die Gruppe versteckt sich im Belfry der Gotham Academy und stößt auf erste Spuren des Geheimbunds „Rat der Eulen“, als ein maskierter Vollstrecker Detective Ford tötet.
Nach dem Mord an Bruce Wayne sind Turner Hayes und seine Freunde — Carrie Kelly alias Robin, die Geschwister Harper und Cullen Row sowie Duela — als Verdächtige auf der Flucht. Über die geheimnisvolle Organisation Court of Owls wissen sie kaum mehr als einen Kinderreim und ein Logo auf einer Uhr. Turner will den Fall aufklären, den Batman bei seinem Tod hinterließ; Carrie schlägt vor, in Bruce Waynes persönlichen Journalen im Wayne Tower nach Hinweisen zu suchen.
Bürgermeister Hamilton Hill stellt eine Sondereinheit zusammen, um die Gruppe zu jagen. Die Hackerin Stephanie Brown weiht ihren Freund Brody in ihre Verbindung zu Turner ein und lernt die übrigen Flüchtigen in deren Versteck kennen. Als die Polizei nachverfolgt, wen Turner aus dem Gewahrsam angerufen hat, wird Stephanie verhaftet — doch Brody nimmt die Schuld für ihren Bankenhack auf sich und nutzt die Beziehungen seines wohlhabenden Vaters, um die Folgen abzumildern.
Harvey Dent entdeckt derweil, dass der Talon die abgetrennten Köpfe von Detective Ford und dessen Männern an das GCPD geschickt hat. Turner plant, über Bruce Waynes privaten Aufzug — dessen Code 1939 auf das Erscheinungsjahr des ersten Batman-Comics verweist — in dessen Büro im Wayne Tower einzudringen. Während Turner und Carrie das Batman-Versteck samt Journalen finden, warten Duela, Harper und Cullen in der Garage; Duela will die erbeutete Court-of-Owls-Uhr verkaufen und fliehen, doch Cullen weigert sich, Turner und Carrie im Stich zu lassen.
In den Journalen erfahren Turner und Carrie, dass der Court seit Generationen Mitglieder der Wayne-Familie jagt und tötet und dass Bruce' Urgroßvater Alan Wayne sein Leben dem Nachweis der Existenz des Court widmete. Da taucht der Talon auf und greift an. Duela lockt Harper und Cullen mit einem Vorwand aus dem Fluchtwagen und fährt allein davon. Mithilfe von Carries Robin-Ausrüstung entkommen die vier dem Talon aus dem Wayne Tower.
Turner erkennt, dass der hohe Preis für die Uhr nicht dem Objekt gilt, sondern dazu dient, ihren Besitzer aufzuspüren — was sich bestätigt, als Duela beim Verkaufsversuch mit einer Waffe bedroht wird. Der Talon tötet den Käufer und will Duela umbringen, doch die Gruppe rettet sie: Turner stellt sich dem Attentäter mit Bruce Waynes Schwert, und Carrie stoppt ihn schließlich mit einem Explosivpfeil, den der Talon jedoch übersteht. Zurück im Versteck bemerkt Turner, dass Seiten aus dem Journal herausgerissen wurden — heimlich von Carrie, die damit ein Geheimnis über Turner verbirgt. Zugleich zeigt sich, dass auch Cressida und Bürgermeister Hill mit dem Court of Owls im Bunde stehen.
Robin, alias Carrie Kelley, überwältigt den Anführer der Mutanten-Bande, Vernon Wagner, mit einem behelfsmäßigen Taser und übergibt ihn der Polizei. Bürgermeister Hamilton Hill schreibt sich den Fahndungserfolg öffentlich zu, woraufhin die Mutanten Rache schwören.
Bei einem Überfall auf Ace Chemicals entwendet die Bande eine Gasbombe und stürmt damit die jährliche Gründer-Gala in Gotham. Sie nimmt zahlreiche Geiseln und fordert Wagners Freilassung. Zu den Gästen zählen der von den Vorwürfen freigesprochene und von seinen Eltern zum Erscheinen gezwungene Brody March sowie Stephanie Brown und Harvey Dent.
Parallel tarnt sich Cullen Row als Polizist und durchsucht das Polizeirevier von Gotham nach Unterlagen zum Mord an Alan Wayne. Turner Hayes, Duela, Harper Row und Robin greifen bei der Gala ein und kämpfen gegen die Mutanten, während Hill den Forderungen nachgibt.
Stephanie gelingt es unter großem Druck, die Gasbombe zu entschärfen; Wagner entkommt jedoch im Chaos. Die von Cullen geborgenen Dokumente bestätigen eine Verbindung zwischen den Morden und dem geheimnisvollen Eulenhof.
Kurz nach der Befreiung der Gala wird Bürgermeister Hill in seiner eigenen Limousine durch Giftgas des Eulenhofs getötet. Daraufhin kündigt Harvey Dent seine Kandidatur für das Amt des Bürgermeisters an.
Die Folge beginnt damit, dass ein verstörter Mann mit seltsamen Wunden durch einen Park irrt, einem Polizisten die Waffe entreißt und sich vor dessen Augen erschießt. Im Verborgenen erkennen die Gotham Knights – Turner, Duela sowie die Geschwister Harper und Cullen mit Hilfe der Hackerin Stephanie –, dass das Messer des Talon dieselben Kreuzmarken hinterlässt wie jene auf der Leiche von Bruce Waynes Vorfahren Alan Wayne. Ein Datenbankabgleich zeigt: Der Rat der Eulen tötet seit über einem Jahrhundert nach diesem Muster.
Der Tote aus dem Park entpuppt sich als Pericles Jones, einer von Bruce Waynes Anwälten. Duela erkennt das Messer wieder: Es stammt von Felix Harmon, dem als „Schlächter von Gotham“ berüchtigten Messerwerfer und Serienmörder, der vor rund hundert Jahren hingerichtet wurde. Seine noch lebende Tochter Eunice Monroe wohnt in einem Pflegeheim in Gotham.
Turner und Harper dringen in Jones' Haus ein, wo dessen Sohn ihnen offenbart, dass Bruce kurz vor seinem Tod sein Testament ändern ließ – und dass der Rat der Eulen den Anwalt deswegen tötete. Derweil befragen Carrie und Duela im Pflegeheim Eunice, die von ihrem angeblich noch lebenden Vater und rätselhaften Spieluhren schwärmt, dann in Wut gerät und den Mädchen mit dem Rat der Eulen droht. Beim Rückzug entwenden sie das Gästebuch des Heims.
Aus den Einträgen schließt die Gruppe, dass Cressida, die Haushälterin von Wayne Manor, Eunice besucht hat und mit dem Rat unter einer Decke steckt. Turner sucht Cressida auf, die eine Waffe zieht und gesteht, Bruces Essen vergiftet zu haben, um ihn für den Talon wehrlos zu machen. Dann taucht der Rat in Eulenmasken auf und bietet Turner sein Leben, wenn er die anderen ausliefert; er lehnt ab. Der Talon lässt sich nicht mit Kugeln aufhalten – erst Carrie als Robin verschafft den beiden über die Bathöhle die Flucht.
Zurück in der Belfry nehmen sie Fingerabdrücke von einer Spieluhr, die Duela entwendet hat, und finden ausgerechnet die des seit hundert Jahren toten Schlächters. Bezirksstaatsanwalt Harvey Dent, der gegen den mit einer Eulen-Münze markierten Lincoln March um das Bürgermeisteramt kämpft, entdeckt einen fremden Schlüssel, der die Limousine des ermordeten Bürgermeisters öffnet. Am Ende versammelt sich der Rat um die zerschossene Leiche des Talon – die sich vor ihren Augen von selbst regeneriert und so die Verbindung zu den unzerstörbaren Messern erklärt.
Um ihre Unschuld an Batmans Tod zu beweisen, verfolgt Turner Hayes' Gruppe eine neue Spur: Über eine Briefkastenfirma wäscht die berüchtigte Mafiafamilie McKillen das Geld des Court of Owls. Harper, die früher mit dem Mafiasohn Dylan McKillen liiert war, kennt den Weg in deren Lager. Die Gruppe will das Kassenbuch stehlen, um die Existenz des Court zu belegen.
Turner, Carrie, Duela und die Row-Zwillinge dringen ins Lager ein und erbeuten das Buch, stoßen dabei aber auf einen großen Geldstapel. Als Dylan McKillen sie entdeckt und Alarm schlägt, schlägt Carrie ihn nieder. Auf der Flucht im gestohlenen Van werfen sie das Geld auf die Straßen Gothams; die Menschenmenge, die sich um die Scheine drängt, blockiert die Polizei und verhilft ihnen zur Flucht.
Weil sie das erbeutete Geld an die Bürger zurückgeben, tauft Gotham News Now die Gruppe »die Gotham Knights«. Parallel bereiten sich Carrie und Stephanie auf das Eltern-Mittagessen der Gotham Academy vor, wo Stephanie mühsam ihre trinkende Mutter im Zaum hält und verbergen muss, dass Carrie den Unterricht schwänzt.
Der stärkste Strang gilt Harvey Dent: Von Blackouts geplagt, fürchtet er, wie sein Vater an einer dissoziativen Identitätsstörung zu leiden. Die Psychologin Chase Meridian winkt ab, doch Dent erwacht schließlich in Rebecca Marchs Haus, ohne zu wissen, wie er dorthin kam – sein Telefon zeigt eine lange Liste von Anrufen an sie. Seine zweite Persönlichkeit, Two-Face, war die ganze Zeit präsent.
Joe Chill, der verurteilte Mörder von Bruce Waynes Eltern, steht kurz vor seiner Hinrichtung auf dem elektrischen Stuhl. Er bittet Harvey Dent darum, mit Turner Hayes sprechen zu dürfen. Bei ihrer Begegnung im Gefängnis gesteht Chill, dass er damals lediglich beauftragt war, die Waynes auszurauben – die tödlichen Schüsse habe ein Unbekannter der Court of Owls aus dem Hinterhalt abgefeuert.
Harvey Dent versucht vergeblich, die Vollstreckung aufzuschieben; der Gouverneur lehnt ab, und Joe Chill wird hingerichtet. Für Turner bedeutet das Geständnis eine erschütternde Erkenntnis über den wahren Mörder seiner Adoptiveltern.
Parallel bittet Stephanie Brown ihren Vater Arthur Brown um Hilfe beim Entschlüsseln eines Hauptbuchs der Court of Owls. Daraus ermittelt das Team den Standort von Opioid-Dealern und schaltet diese aus. Während des Einsatzes rettet Harper Row Stephanie vor einem tödlichen Schuss, was die beiden einander näherbringt.
Am Ende versucht Harvey Dent, Lincoln March zu warnen, wird jedoch von einem Schwindelanfall übermannt und von einem Talon der Court of Owls niedergestochen. Die Folge vertieft damit die Verschwörung um die Court of Owls und bereitet Harvey Dents zunehmende Verwandlung und Isolation vor.
Eine Reihe spektakulärer Kunstdiebstähle hält Gotham in Atem. Als Stephanie herausfindet, dass alle entwendeten Gemälde zum Todeszeitpunkt Alan Wayne gehörten – einem Vorfahren Bruce Waynes –, wird aus scheinbar belanglosen „teuren Farbklecksen" ein Fall für die Gotham Knights. Turner und sein Team vermuten dahinter eine Verbindung zum geheimnisvollen Rat der Eulen.
Während die anderen einem Kunstdieb nachjagen, gehen Duela und Carrie ihren eigenen Weg: Duela entführt die betagte Eunice Harmon, Tochter des Talon Felix Harmon, um endlich zu erfahren, warum ihr „Papa" so lange lebt. Widerwillig gibt Eunice preis, dass der Rat der Eulen den zum Tode verurteilten Schlächter mit einer geheimnisvollen Substanz am Leben hielt und zu seinem Vollstrecker machte – der letzte Rest davon wurde an Felix verbraucht, weshalb die Eulen seither nach Nachschub suchen.
Doch die scheinbar gebrechliche Eunice ist gefährlicher, als sie wirkt: Sie rammt Duela einen in der Spieldosen-Ballerina versteckten Dorn in die Hand und würgt sie beinahe, ehe Carrie rettend eingreift. Parallel entlarven die Knights den Kunstdieb – es ist Detective Sophia Green, die von den Eulen gezwungen wird, die Bilder zu stehlen, weil diese Frau und Tochter der Ermittlerin als Geiseln halten.
Die Knights beschaffen das letzte noch fehlende Gemälde aus dem Depot des Kane-Museums und treten zum Geiselaustausch an. Als der Rat der Eulen sein Wort brechen und Turner samt Geiseln töten lassen will, spielt Duela ihren Trumpf aus und führt Eunice als „Lebensversicherung" vor. Der Plan geht auf: Greens Familie und die Knights kommen frei.
Unterdessen fürchtet Rebecca March um ihr Leben und sucht Halt bei Harvey Dent; aus ihrer Nähe wird mehr, bis ein Anruf meldet, dass der komatöse Lincoln March erwacht ist. Zum Schluss löst Duela beim Zurücklegen der Ballerina ein verborgenes Fach der Spieldose aus – voller Fotos maskierter Eulen. In der Schlussmontage bittet Cressida Clarke Harvey um Hilfe, weil sie die Pläne des Rates kennt, während die Eulen die erbeuteten Gemälde verbrennen und darunter eine metallische Substanz kartenartige Muster freilegt.
Eine Spur kryptischer Hinweise führt Turner und Duela zu einem der geheimen Treffen des Gerichts der Eulen. Nachdem die Knights einen Waffendeal auffliegen lassen, entdeckt Stephanie, dass die stehengebliebenen Uhren der Eulen in Wahrheit Längen- und Breitengrade verschlüsseln und damit Zeit und Ort des Treffens verraten.
Mit zwei am 3D-Drucker gefertigten Masken schleusen sich Turner und Duela unter die Mitglieder. Dort enthüllt die Anführerin, warum das Gericht so verbissen hinter bestimmten Gemälden her ist: In einem von ihnen ist eine Karte verborgen, die zu einer Substanz namens Elektrum führen soll, dem vermeintlichen Schlüssel zu ewigem Leben.
Abseits der Ermittlungen muss Stephanie erkennen, dass die Sucht ihrer Mutter weit schlimmer ist als befürchtet, und wendet sich hilfesuchend an ihren Vater Arthur. Ein Zeitsprung wiederum führt Harvey Dent zu einer verblüffenden Entdeckung.
Turner Hayes schwebt in Lebensgefahr: Bei ihm wird eine Strahlenvergiftung diagnostiziert, er selbst ist radioaktiv. Die einzige Rettung ist eine Bluttransfusion. Carrie holt Turner aus den Tunneln und schleust ihn heimlich ins Gotham General Hospital, wo sie Dr. Kelley zur Hilfe überredet. Dem Arzt gelingt es, Turner zu stabilisieren.
Am Krankenbett gesteht Carrie ihm ein schweres Geheimnis: Sie hat einige Seiten aus Bruce Waynes Tagebuch herausgerissen. Die fehlenden Einträge legen nahe, dass Bruce am Tod von Turners Eltern beteiligt gewesen sein könnte – eine Enthüllung, die alles Bisherige in ein neues Licht rückt.
An anderer Stelle macht Brody eine folgenschwere Entdeckung: Er findet die Eulenmaske seines Vaters aus dem Court of Owls sowie ein Video, das seinen Vater beim Mord an Cressida Clark zeigt. Arglos erzählt Brody seiner Mutter Rebecca, dass er mit Stephanie darüber gesprochen hat – ohne zu ahnen, dass Rebecca selbst Teil des Court ist.
Rebecca March erweist sich als noch tiefer in den geheimen Zirkel verstrickt als ihr Mann. Kühl weist sie Lincoln an, dass man sich um Stephanie kümmern müsse. Zum Ende der Folge finden Turner und Duela nach einer ganzen Staffel voller Andeutungen schließlich zueinander.
Duela feiert Geburtstag und trifft ihre Mutter Jane Doe wieder, die eine Bombendrohung beim GCPD als Signal genutzt hatte, um mit ihrer Tochter Kontakt aufzunehmen. Das Wiedersehen bringt eine erschütternde Enthüllung: Duela ist nicht die Tochter des Jokers, sondern die von Harvey Dent.
Jane Doe behauptet, Harvey habe sie einst wegsperren lassen und die gemeinsame Beziehung stets geleugnet. Auf Drängen ihrer Mutter schießt Duela auf Harvey – er überlebt nur, weil eine Münze des Gerichts der Eulen in seiner Brusttasche die Kugel aufhält.
Parallel steht Stephanie ihrem Vater gegenüber und muss sich zwischen ihrer Familie und den Knights entscheiden. Das bringt sie in Konflikt mit Harper, doch am Ende weigert sie sich, ihre Freunde zu verraten.
Die Knights entdecken, dass Turners Ansteckkamera aus dem heimlichen Treffen des Gerichts der Eulen nur noch einen schwachen Akku meldet – die belastende Aufnahme existiert also noch. Stephanie und Harper nutzen die Siegesfeier von Lincoln March zum neuen Bürgermeister und brechen in den March Tower ein, um Kamera und Video sicherzustellen.
Im Gebäude eingeschlossen, verstecken sie sich auf dem geheimen dreizehnten Stockwerk – der sogenannten Etage N, die Alan Wayne aus Aberglauben errichten ließ, um Unglück zu bannen. Dort befreien sie den angeschlagenen Brody, der von der Verstrickung seiner Mutter in die Machenschaften des Gerichts berichtet.
Aus Brodys Aussage und alten Zeitungsartikeln, die Harvey auf der dreizehnten Etage findet, ergibt sich die eigentliche Wahrheit: Nicht Lincoln, sondern Rebecca March – einst Dr. Rebekah Leviticus – steht an der Spitze des Gerichts der Eulen. Unentdeckt aus dem Wayne Tower heraus baute sie den Zirkel auf und entdeckte das Electrum, den vermeintlichen Schlüssel zur Unsterblichkeit.
Parallel erfährt Duela von Turner, dass ihre wiedergefundene Mutter Jane ihn betäubt und der Polizei ausgeliefert hat – das ersehnte Wiedersehen endet in bitterer Enttäuschung. Am Ende werden die Knights vom Gotham City Police Department festgenommen; die Medien berichten bereits, dass für die jungen Flüchtigen die Todesstrafe gefordert werden soll.
Das Serienfinale beginnt mit den Gotham Knights hinter Gittern: Rebecca March hat der Gruppe die Verbrechen des geheimen Court of Owls angehängt, sodass sie für den Mord verantwortlich gemacht und verhört werden. Um sich zu befreien und die Stadt zu warnen, müssen die Jugendlichen der Polizei und ganz Gotham beweisen, dass nicht sie den neuen Bürgermeister und dessen Frau getötet haben – während die Talons ihnen bereits auf den Fersen sind.
Rebecca March verfolgt einen verheerenden Plan: Sie will mehrere Gebäude in der Stadt in die Luft sprengen. In einem Wettlauf gegen die Zeit setzen die Knights alles daran, den Anschlag zu vereiteln und die wahre Verantwortliche zu entlarven. Die Folge stellt das Vertrauen der Gruppe auf die Probe – nur wenn sie einander vertrauen, können sie sich und Gotham retten.
Parallel vollzieht sich Harvey Dents endgültige Wandlung. Erstmals tritt er körperlich wie mental vollständig als Two-Face auf. Er sucht Jane Doe, die Mutter von Duela, auf, um sich für den Verrat an ihrer gemeinsamen Tochter zu rächen. Bereit, sie zu töten, überlässt er die Entscheidung dem Wurf seiner Münze.
Im Finale geben die Gotham Knights ihre Identitäten öffentlich preis, um Gotham vor der drohenden Zerstörung durch Rebecca March zu bewahren. Turner wird zu dem Mann gebracht, der einst seine als Assassinen ausgebildeten Eltern und auch Batman trainiert hat – und der ihm nun anbietet, ihn selbst auszubilden.
Da die Serie nach der ersten Staffel eingestellt wurde, bildet „Die Nacht der Eulen“ zugleich den endgültigen Abschluss von Gotham Knights. Der offene Ausblick auf Turners Ausbildung bleibt damit ein Handlungsfaden, der nicht mehr weitergeführt wird.