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Nachdem Bruce Wayne ermordet wurde, schmiedet sein Adoptivsohn eine unwahrscheinliche Allianz mit den Kindern von Batmans Feinden, als sie alle für die Ermordung des Caped Crusaders verantwortlich gemacht werden.
Um ihre Namen reinzuwaschen, begeben sich Turner, Duela, Cullen, Harper und Carrie auf der Suche nach Bruce Waynes Tagebüchern an den Tatort zurück. Währenddessen beginnt Harvey sich zu fragen, ob Turner nicht doch unschuldig ist, während er die Ermittlungen vorantreibt. Schließlich wird Stephanie zur Befragung vorgeladen, nachdem das GCPD vermutet, dass sie Turner helfen könnte.
Nachdem ihr Anführer von Carrie ausgeschaltet wurde, rächt sich die Mutantenbande an Gotham, indem sie bei der jährlichen Gründergala Geiseln nimmt, was Turner, Duela und Harper dazu zwingt, aus ihrem Versteck zu kommen, um die Menschen in Gotham zu retten. An anderer Stelle infiltriert Cullen das GCPD, nachdem das Team eine mögliche Verbindung zwischen dem Eulenhof und dem Tod eines weiteren Mitglieds der Familie Wayne aufgedeckt hat. Und schließlich trifft Harvey eine wichtige Entscheidung über seine Zukunft.
Nachdem sie bei ihren Ermittlungen einige mögliche Hinweise entdeckt haben, untersuchen Turner und Harper eine mögliche Verbindung zwischen Bruce Waynes Tod und dem mysteriösen Tod eines Anwalts. In der Zwischenzeit fahren Carrie und Duela zu einem Pflegeheim, um Eunice zu befragen. Im Belfry öffnet sich Stephanie gegenüber Cullen über ihr Leben zu Hause, während Harvey eine beunruhigende Entdeckung macht.
Ein Plan, den Eulenhof zu Fall zu bringen, führt Turner und das Team zu einer berüchtigten Mafioso-Familie, den McKillens. Währenddessen bereiten sich Carrie und Stephanie auf den Elternabend der Gotham Academy vor, und Harvey sucht Hilfe bei einem Psychiater.
Als Joe Chill für den Mord an Bruce Waynes Eltern hingerichtet werden soll, wendet er sich an Harvey mit der Bitte, mit Turner zu sprechen. In der Zwischenzeit sucht Stephanie Hilfe bei ihrem Vater Arthur Brown, als sie Probleme hat, einen Code zu knacken, und Carrie ist gezwungen, im Krankenhaus zu helfen, nachdem ihr geheimes Leben als Selbstjustizler sie in Schwierigkeiten mit ihrer Mutter gebracht hat.
Nach einer Reihe von Kunstraubüberfällen in Gotham richten Turner und die Knights ihre Aufmerksamkeit auf eine mögliche Verbindung zum Eulenhof. Währenddessen suchen Duela und Carrie bei Eunice nach Antworten über das Talon, und Rebecca wendet sich an Harvey, weil sie befürchtet, dass ihr Leben in Gefahr ist.
Eine Reihe von kryptischen Hinweisen führt Turner und Duela zu einem der geheimen Treffen des Hofes. Währenddessen erfährt Stephanie, dass die Sucht ihrer Mutter schlimmer ist, als sie dachte, und wendet sich hilfesuchend an ihren Vater Arthur. Schließlich führt ein Zeitsprung Harvey zu einer verblüffenden Entdeckung.
Nachdem einer von ihnen vom Eulenhof gefangen genommen wurde, befinden sich die Ritter in einem Wettlauf mit der Zeit. Stephanie und Harper arbeiten zusammen, um ein entscheidendes Stück Material zu finden, das ihr Teammitglied retten könnte. Harvey ergreift Maßnahmen, um sich zu schützen, doch seine schlimmsten Befürchtungen werden bestätigt.
Als einer von ihnen in Schwierigkeiten gerät, versucht das Team verzweifelt, eine Lösung zu finden, bevor es zu spät ist. An anderer Stelle unternimmt Harvey einen riskanten Schachzug, um die Antworten zu bekommen, die er sucht. Schließlich wendet sich Brody an Stephanie, nachdem er über Informationen gestolpert ist, die seinen Vater Lincoln betreffen.
Duelas Geburtstagswiedersehen mit ihrer Mutter, Jane Doe, bringt schockierende Informationen ans Licht, die sie unwiderruflich verändern werden. In der Zwischenzeit ist Stephanie gezwungen, sich zwischen ihrer Familie und den Knights zu entscheiden, was sie in Konflikt mit Harper bringt. Schließlich befindet sich Harvey auf Kollisionskurs mit jemandem aus seiner Vergangenheit.
Die Knights entdecken, dass Turners Ansteckkamera aus dem heimlichen Treffen des Gerichts der Eulen nur noch einen schwachen Akku meldet – die belastende Aufnahme existiert also noch. Stephanie und Harper nutzen die Siegesfeier von Lincoln March zum neuen Bürgermeister und brechen in den March Tower ein, um Kamera und Video sicherzustellen.
Im Gebäude eingeschlossen, verstecken sie sich auf dem geheimen dreizehnten Stockwerk – der sogenannten Etage N, die Alan Wayne aus Aberglauben errichten ließ, um Unglück zu bannen. Dort befreien sie den angeschlagenen Brody, der von der Verstrickung seiner Mutter in die Machenschaften des Gerichts berichtet.
Aus Brodys Aussage und alten Zeitungsartikeln, die Harvey auf der dreizehnten Etage findet, ergibt sich die eigentliche Wahrheit: Nicht Lincoln, sondern Rebecca March – einst Dr. Rebekah Leviticus – steht an der Spitze des Gerichts der Eulen. Unentdeckt aus dem Wayne Tower heraus baute sie den Zirkel auf und entdeckte das Electrum, den vermeintlichen Schlüssel zur Unsterblichkeit.
Parallel erfährt Duela von Turner, dass ihre wiedergefundene Mutter Jane ihn betäubt und der Polizei ausgeliefert hat – das ersehnte Wiedersehen endet in bitterer Enttäuschung. Am Ende werden die Knights vom Gotham City Police Department festgenommen; die Medien berichten bereits, dass für die jungen Flüchtigen die Todesstrafe gefordert werden soll.
Das Serienfinale beginnt mit den Gotham Knights hinter Gittern: Rebecca March hat der Gruppe die Verbrechen des geheimen Court of Owls angehängt, sodass sie für den Mord verantwortlich gemacht und verhört werden. Um sich zu befreien und die Stadt zu warnen, müssen die Jugendlichen der Polizei und ganz Gotham beweisen, dass nicht sie den neuen Bürgermeister und dessen Frau getötet haben – während die Talons ihnen bereits auf den Fersen sind.
Rebecca March verfolgt einen verheerenden Plan: Sie will mehrere Gebäude in der Stadt in die Luft sprengen. In einem Wettlauf gegen die Zeit setzen die Knights alles daran, den Anschlag zu vereiteln und die wahre Verantwortliche zu entlarven. Die Folge stellt das Vertrauen der Gruppe auf die Probe – nur wenn sie einander vertrauen, können sie sich und Gotham retten.
Parallel vollzieht sich Harvey Dents endgültige Wandlung. Erstmals tritt er körperlich wie mental vollständig als Two-Face auf. Er sucht Jane Doe, die Mutter von Duela, auf, um sich für den Verrat an ihrer gemeinsamen Tochter zu rächen. Bereit, sie zu töten, überlässt er die Entscheidung dem Wurf seiner Münze.
Im Finale geben die Gotham Knights ihre Identitäten öffentlich preis, um Gotham vor der drohenden Zerstörung durch Rebecca March zu bewahren. Turner wird zu dem Mann gebracht, der einst seine als Assassinen ausgebildeten Eltern und auch Batman trainiert hat – und der ihm nun anbietet, ihn selbst auszubilden.
Da die Serie nach der ersten Staffel eingestellt wurde, bildet „Die Nacht der Eulen“ zugleich den endgültigen Abschluss von Gotham Knights. Der offene Ausblick auf Turners Ausbildung bleibt damit ein Handlungsfaden, der nicht mehr weitergeführt wird.