Die Serie nutzt den aus Akte X bekannten Mix aus thematisch selbstständigen „Monster-of-the Week“-Folgen und der Verfolgung eines roten Fadens. Die Handlung bezieht sich teilweise auf bekannte moderne Legenden und Mythen verschiedenster Religionen.

Im Mittelpunkt der Serie stehen die Brüder Dean und Sam Winchester, die ein dunkles Geheimnis verbindet: Vor 22 Jahren wurde ihre Mutter auf grausame Weise von einem Dämon getötet. Seitdem hat es sich ihr Vater John Winchester zur Lebensaufgabe gemacht, übernatürliche Wesen, die das Leben Unschuldiger bedrohen, zu jagen und zu töten. Auf der Suche nach dem Mörder seiner Frau trainierte er auch seine Söhne zu professionellen Monsterjägern.