Peter Parker (Tobey Maguire) ist ein nerdiger Schüler im letzten Jahr an einer Highschool in New York City. Seine Eltern sind verstorben, daher lebt er bei seinem Onkel Ben (Cliff Robertson) und seiner Tante May (Rosemary Harris). Peter hat ein Auge auf seine Nachbarin Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) geworfen. Sie ist eine der wenigen Mitschülerinnen, die nett zu ihm sind. Ihr Freund Flash (Joe Manganiello) und dessen Kumpel ärgern Peter ständig. Sein einziger Freund ist Harry Osborn (James Franco), der trotz seines Wohlstands und guten Aussehens ebenso ein Außenseiter ist. Harry ist etwas eifersüchtig auf die Zuneigung seines Vaters Norman (Willem Dafoe) gegenüber Peter. Norman, der Chef des Waffenherstellers Oscorp, schätzt Peters wissenschaftliche Fähigkeiten.
Peters Klasse macht einen Ausflug zu einem Genetiklabor der Columbia University. Dort wird an Spinnen geforscht, und sogar neue Spinnenarten wurden durch genetische Manipulation geschaffen. Während Peter Fotos von Mary Jane für die Schülerzeitung macht, wird er von einer dieser neuen Spinnen gebissen. Er fühlt sich krank und geht sofort nach Hause ins Bett. Das Gift der Spinne beginnt, auf genetischer Ebene Magie auf Peter zu wirken.
Zwischenzeitlich besucht General Slocum (Stanley Anderson) Oscorp, um die Ergebnisse ihres neuen Supersoldaten-Formels zu begutachten. Als einer von Normans Top-Wissenschaftlern, Dr. Stromm (Ron Perkins), warnt, dass die Formel instabil ist, droht Slocum, alle Militärmittel von Oscorp abzuziehen. Norman testet die Formel an sich selbst, bekommt übermenschliche Kräfte und Beweglichkeit, wird aber wahnsinnig. Er tötet Stromm und stiehlt zwei Oscorp-Erfindungen: ein Exoskelett und einen Jet-Gleiter.
Am nächsten Morgen erwacht Peter und fühlt sich besser als je zuvor. Er bemerkt, dass er nun muskulös und seine Sehkraft perfekt ist. In der Schule entdeckt er, dass er Netze aus seinen Handgelenken schießen kann und eine neue Beweglichkeit hat, mit der er Mary Jane und ihr Tablett beim Ausrutschen auffängt und Flash in einem Faustkampf besiegt. Nachts flirtet er mit Mary Jane über den Gartenzaun, bis Flash mit seinem neuen Auto auftaucht. Um Mary Jane zu beeindrucken, glaubt Peter, dass er auch ein Auto braucht, weiß aber, dass weder er noch seine finanziell angespannten Pflegeeltern sich eines leisten können.
Peter entdeckt in der Zeitung eine Anzeige: Ein lokaler Wrestling-Veranstalter bietet $3000 für jemanden, der drei Minuten im Ring mit ihrem Champion Bone Saw (Randy "Macho Man" Savage) überlebt. Peter entwirft ein Kostüm und geht zur Arena, sagt Ben und May, dass er zur Bibliothek geht. Besorgt über Peters Verhaltensänderungen fährt Ben ihn zur "Bibliothek" und erklärt ihm seine Bedenken und die Verantwortung, die Macht mit sich bringt. Peter reagiert gereizt und besteht darauf, dass Ben nicht sein Vater ist.
Trotzdem besiegt Peter Bone Saw im Kampf, erhält aber nur $100 anstelle der versprochenen $3000. Wütend steht Peter tatenlos daneben, als ein Räuber (Michael Papajohn) den Promoter ausraubt. Doch draußen entdeckt er, dass derselbe Räuber Ben tödlich verwundet und sein Auto gestohlen hat. Peter jagt den Räuber, der in einem Handgemenge aus einem Fenster fällt und stirbt. In derselben Nacht zerstört der nun als "Green Goblin" bekannte Norman Osborn bei einem Angriff ein Konkurrentenprojekt von Quest Aerospace und tötet General Slocum.
Peter verspricht sich, seine Kräfte zum Wohl der Allgemeinheit einzusetzen. Er entwirft ein neues Kostüm und bekämpft als der Erstaunliche Spider-Man Straßenkriminalität in New York. Trotz Missbilligung des Zeitungsverlegers J. Jonah Jameson (J.K. Simmons) schreibt dieser eine Anzeige für gute Fotos von Spider-Man aus. Peter, Harry und Mary Jane ziehen nach dem Schulabschluss nach Manhattan. Peter und Harry teilen sich eine Loftwohnung und besuchen Kurse an der Empire State University. Mary Jane arbeitet als Kellnerin und bemüht sich um Schauspielrollen.
Peter hat Probleme, einen Job zu finden. Norman bietet ihm Hilfe an, doch Peter möchte auf eigenen Füßen stehen. Mit der Kamera fängt Peter Spider-Mans Heldentaten ein und verkauft die Bilder an Jameson, der wenig zahlt, aber weitere Fotos kauft. Norman ist zunächst zufrieden über den Aufschwung von Oscorp, doch als das Unternehmen von Quest gekauft werden soll, kommt Normans gespaltene Persönlichkeit als Green Goblin zum Vorschein. Goblin zerstört Oscorps Vorstand bei einem Angriff und gefährdet Mary Jane, die von Spider-Man gerettet wird. Mary Jane verliebt sich in Spider-Man, ohne zu wissen, dass es Peter ist.
Goblin schlägt eine Partnerschaft vor und lockt Spider-Man in eine Falle bei der Daily Bugle. Spider-Man lehnt ab, und die beiden kämpfen immer wieder, wobei Goblin bei Thanksgiving entdeckt, dass Peter Spider-Man ist. Goblin greift Tante May an, wodurch sie ins Krankenhaus muss, und verliebt sich unwissentlich in Peter. Harry erkennt das Ende seiner Beziehung zu Mary Jane, als er sie und Peter bei einem intimen Moment beobachtet.
Schließlich entführt Goblin Mary Jane und sabotiert eine Straßenbahn. Spider-Man rettet beide mit Hilfe der Passanten vor dem wütenden Goblin, der sie in ein verlassenes Gebäude wirft. Im Kampf droht Goblin Mary Jane zu töten, was Spider-Man rasend macht, und besiegt ihn fast, bevor Norman seine wahre Identität offenbart. Goblin versucht, Spider-Man zu töten, stirbt aber selbst. Spider-Man bringt Normans Leiche nach Hause, doch Harry denkt, Spider-Man habe seinen Vater getötet.
Bei der Beerdigung dankt Harry Peter für seine Freundschaft und verspricht Rache. Mary Jane gesteht Peter ihre Liebe, er weicht jedoch aus und betont, dass sie nur Freunde sein können. Peter akzeptiert sein Schicksal: "Wer bin ich? Ich bin Spider-Man."
Oliver Trebes
