Wissenschaftler Richard Parker (Campbell Scott) zeichnet eine Videobotschaft auf, um sein Verschwinden zu erklären. Zuvor löscht und zerstört er alle Arbeiten, die er für Oscorp an Spinnen und genetischen Mutationen durchgeführt hat. Später sind Richard und seine Frau Mary (Embeth Davidtz) an Bord eines Privatjets, der von einem Attentäter gekapert wird. Dieser hat bereits den Piloten getötet und schießt auf Mary, bevor er in einen brutalen Kampf mit Richard verwickelt wird, um Zugang zu seinem Laptop zu erhalten. Richard wirft den Attentäter aus dem Flugzeug. Mit dem toten Piloten stürzt das Flugzeug ab. Kurz vor dem Absturz lädt Richard all seine Arbeiten und Dateien auf einen Satellitenserver namens Roosevelt hoch.
In der Gegenwart bekämpft Richards und Marys Sohn Peter (Andrew Garfield) als Spider-Man Verbrechen. Er schnappt Aleksei Sytsevich (Paul Giamatti), der versucht hat, ein Oscorp-Lastwagen voller Plutoniumampullen zu stehlen, und rettet den Oscorp-Mitarbeiter Max Dillon (Jamie Foxx), der im Weg des Lastwagens durch die Straßen von New York stand. Peter rettet alle Plutoniumampullen und sorgt dafür, dass keine beschädigt wird. Dann verhaftet er Aleksei, der den Lastwagen in einen öffentlichen Bus fährt. Peter rettet einen alten Mann und ein kleines Mädchen vor dem zerquetschenden Bus.
Während eines Telefonats mit Gwen Stacy (Emma Stone) erscheint Peter eine Vision ihres verstorbenen Vaters, Polizeikapitän George Stacy (Denis Leary), der ihn daran erinnert, Gwen aus seinen Spider-Man-Angelegenheiten herauszuhalten. Peter kommt zu spät zu seiner eigenen Abschlussfeier und küsst Gwen auf der Bühne. Nach ihrem Schulabschluss treffen sich Peter und Gwen in einem Restaurant, wo Peter ihr sagt, dass er das Versprechen an ihren Vater halten und sich von ihr fernhalten muss; enttäuscht beendet Gwen die Beziehung. Peter bemüht sich sehr, seine Superhelden-Identität vor seiner Tante May (Sally Field) zu verbergen.
Max arbeitet bei Oscorp und hat viele der Schaltkreise entworfen, die nun zur Stromversorgung Manhattans durch Oscorps neue elektromagnetische Kraftwerke genutzt werden. Max ist ein großer Fan von Spider-Man, seit dieser sein Leben gerettet hat. In der Stadt wird darüber debattiert, ob ein maskierter Rächer wie Spider-Man all die Schäden und Probleme wert ist, die er durch seine Heldentaten verursacht. Max trifft Gwen im Oscorp-Hauptquartier, wo Gwen als Praktikantin arbeitet.
Peters Kindheitsfreund Harry Osborn (Dane DeHaan) kehrt nach Manhattan zurück, um seinen todkranken Vater Norman (Chris Cooper), den CEO von Oscorp, zu sehen. Norman erklärt, dass seine Krankheit (Retrovirale Hyperplasie) erblich ist und Harry nun im Alter ist, in dem sie erstmals auftritt. Er übergibt Harry ein kleines Gerät, das seine Lebensarbeit enthält. Norman will, dass Harry dort erfolgreich ist, wo er selbst versagte. Am nächsten Tag stirbt Norman, und der 20-jährige Harry wird zum neuen CEO von Oscorp ernannt. Harry beschuldigt den Oscorp-Vorstand, ihm die Kontrolle entrissen zu haben, da sie über Normans geheime biogenetische Projekte für ausländische Militärmächte Bescheid wussten. Felicia Hardy (Felicity Jones), Normans Assistentin, wird nun Harrys Assistentin bei Oscorp. Peter knüpft wieder Kontakt zu Harry und erzählt ihm von seiner Beziehung zu Gwen.
Max, der sich für Spider-Man als "bester Freund" hält, wird bei Wartungsarbeiten in einem Oscorp-Labor elektrisiert und fällt in einen Tank mit genetisch veränderten elektrischen Aalen, die zur Stromerzeugung für Manhattan eingesetzt werden. Die Aale beißen Max mehrfach und verwandeln ihn in einen lebenden Stromgenerator. Oscorp-Vizepräsident Menken (Colm Feore) wusste von diesem Unfall, verbarg ihn jedoch vor Harry, um ihn aus dem Unternehmen zu drängen. Harry hatte Menken bei Vorstandssitzungen oft verärgert.
Peter versucht, eine Freundschaft mit Gwen aufrechtzuerhalten, aber als sie ihm von einem Stipendienangebot an der Universität Oxford erzählt, das sie nach Großbritannien führen könnte, taucht Max nach seinem Unfall in der Oscorp-Zentrale in Times Square auf und verursacht unbeabsichtigt einen Stromausfall. Spider-Man versucht, ihn zu beruhigen, aber die Polizei schießt auf Max, und Spider-Mans anschließende Rettung der bedrohten Bürger lenkt die mediale Aufmerksamkeit von Max ab, was ihn wütend macht und ihn angreifen lässt. Spider-Man stoppt ihn schließlich, und Max wird ins Ravencroft-Institut gebracht.
Harrys Krankheit beginnt sich zu zeigen, und er schlussfolgert, dass Spider-Mans Blut ihn retten könnte, und bittet Peter, Spider-Man zu finden. Peter versucht ihn abzuhalten, unsicher, welche Auswirkungen eine Bluttransfusion haben könnte, und obwohl er Harry als Spider-Man begegnet, lehnt er dennoch ab. Harry beginnt Spider-Man zu hassen. Die Oscorp-Vorstandsmitglieder beschuldigen Harry, Max' Unfall vertuscht zu haben, und entfernen ihn als CEO. Harrys Assistentin Felicia informiert ihn über Ausrüstung, die ihm helfen könnte; er arbeitet mit Max zusammen (den er aus Ravencroft befreit), um wieder ins Oscorp-Gebäude zu gelangen, wo er eine von Norman entworfene Rüstung und Gift von genetisch veränderten Spinnen findet. Das Gift beschleunigt seine Krankheit und verwandelt ihn in eine koboldähnliche Kreatur, aber die Notfallprotokolle der Rüstung stellen seine Gesundheit wieder her.
Peter entdeckt in Richards Aktentasche, dass Roosevelt ein verlassenes U-Bahn-Depot ist, und findet in einem Eisenbahnwaggon alle Arbeiten seines Vaters. Peter nutzt die Informationen aus dem versteckten Labor seines Vaters, um eine Videobotschaft zu finden; Richard erklärt, dass er gehen musste, weil er sich geweigert hatte, mit Normans bio-genetischen Waffenentwicklungsplänen zu kooperieren.
Peter erhält eine Voicemail von Gwen, in der sie ihm mitteilt, dass sie das Stipendium an Oxford erhalten hat und früher als erwartet nach Großbritannien abreisen wird. Bevor sie abreist, trifft er sie und gesteht ihr seine Liebe. Als Max einen weiteren Stromausfall verursacht, gehen Peter und Gwen, um ihn zu bekämpfen. Sie stellen die Stromversorgung wieder her und überlasten Max' Körper, wodurch er stirbt.
Harry erscheint mit Normans Rüstung und Waffen; er erkennt Spider-Mans wahre Identität und entführt Gwen. Er kämpft mit Spider-Man auf dem Dach eines Uhrenturms. Spider-Man besiegt Harry, aber trotz seiner Bemühungen stirbt Gwen bei einem Sturz. Ein verzweifelter Peter gibt seine Identität als Spider-Man auf und verbringt mehrere Tage im Jahr an Gwens Grab.
In den nächsten fünf Monaten erholt sich Harry bei Ravencroft von seiner Verwandlung. Sein Vertrauter Gustav Fiers (Michael Massee) besucht ihn und befreit Sytsevich aus dem Gefängnis. Mit einer mechanischen Rüstung ausgestattet, nennt sich Sytsevich "Rhino" und verursacht Chaos in den Straßen. Peter, inspiriert von Gwens Abschlussrede, stellt sich ihm wieder als Spider-Man entgegen.
Oliver Trebes
